vijesti

U proteklom desetljeću, tehnologija sekvenciranja gena široko se koristi u istraživanju raka i kliničkoj praksi, postavši važan alat za otkrivanje molekularnih karakteristika raka. Napredak u molekularnoj dijagnostici i ciljanoj terapiji potaknuo je razvoj koncepata precizne terapije tumora i donio velike promjene u cijelo područje dijagnostike i liječenja tumora. Genetsko testiranje može se koristiti za upozoravanje na rizik od raka, usmjeravanje odluka o liječenju i procjenu prognoze te je važan alat za poboljšanje kliničkih ishoda pacijenata. Ovdje sažimamo nedavne članke objavljene u CA Cancer J Clin, JCO, Ann Oncol i drugim časopisima kako bismo pregledali primjenu genetskog testiranja u dijagnostici i liječenju raka.

Somatske mutacije i mutacije zametne linije. Općenito, rak je uzrokovan mutacijama DNA koje se mogu naslijediti od roditelja (mutacije zametne linije) ili steći s godinama (somatske mutacije). Mutacije zametne linije prisutne su od rođenja, a mutator obično nosi mutaciju u DNA svake stanice u tijelu i može se prenijeti na potomstvo. Somatske mutacije pojedinci stječu u negametskim stanicama i obično se ne prenose na potomstvo. I zametne i somatske mutacije mogu uništiti normalnu funkcionalnu aktivnost stanica i dovesti do maligne transformacije stanica. Somatske mutacije ključni su pokretač malignosti i najprediktivniji biomarker u onkologiji; međutim, otprilike 10 do 20 posto pacijenata s tumorima nosi mutacije zametne linije koje značajno povećavaju rizik od raka, a neke od tih mutacija su također terapijske.
Mutacija pogonitelja i mutacija putnika. Nisu sve varijante DNK ovisne o funkciji stanica; u prosjeku je potrebno pet do deset genomskih događaja, poznatih kao "mutacije pogonitelja", da bi se pokrenula normalna degeneracija stanica. Mutacije pogonitelja često se javljaju u genima usko povezanim s aktivnostima staničnih života, poput gena uključenih u regulaciju rasta stanica, popravak DNK, kontrolu staničnog ciklusa i druge životne procese, te imaju potencijal da se koriste kao terapijske mete. Međutim, ukupan broj mutacija u bilo kojem raku je prilično velik, u rasponu od nekoliko tisuća kod nekih karcinoma dojke do više od 100 000 kod nekih vrlo varijabilnih karcinoma debelog crijeva i endometrija. Većina mutacija nema ili ima ograničen biološki značaj, čak i ako se mutacija dogodi u kodirajućoj regiji, takvi beznačajni mutacijski događaji nazivaju se "mutacije putnika". Ako genska varijanta u određenom tipu tumora predviđa njegov odgovor na liječenje ili otpornost na njega, varijanta se smatra klinički operabilnom.
Onkogeni i tumor supresorski geni. Geni koji često mutiraju kod raka mogu se grubo podijeliti u dvije kategorije, onkogene i tumor supresorske gene. U normalnim stanicama, protein kodiran onkogenima uglavnom igra ulogu u poticanju proliferacije stanica i inhibiranju apoptoze stanica, dok je protein kodiran onkosupresorskim genima uglavnom odgovoran za negativnu regulaciju diobe stanica kako bi se održala normalna funkcija stanica. U procesu maligne transformacije, genomska mutacija dovodi do pojačanja aktivnosti onkogena i smanjenja ili gubitka aktivnosti onkosupresorskih gena.
Mala varijacija i strukturna varijacija. To su dvije glavne vrste mutacija u genomu. Male varijante mijenjaju DNK promjenom, brisanjem ili dodavanjem malog broja baza, uključujući umetanje baza, brisanje, pomicanje okvira čitanja, gubitak početnog kodona, gubitak stop kodona itd. Strukturna varijacija je veliko preuređenje genoma, koje uključuje segmente gena veličine od nekoliko tisuća baza do većine kromosoma, uključujući promjene broja kopija gena, brisanje kromosoma, duplikaciju, inverziju ili translokaciju. Ove mutacije mogu uzrokovati smanjenje ili poboljšanje funkcije proteina. Osim promjena na razini pojedinačnih gena, genomski potpisi također su dio izvješća o kliničkom sekvenciranju. Genomski potpisi mogu se promatrati kao složeni obrasci malih i/ili strukturnih varijacija, uključujući opterećenje tumorskim mutacijama (TMB), mikrosatelitsku nestabilnost (MSI) i homologne rekombinacijske defekte.

Klonske mutacije i subklonske mutacije. Klonske mutacije prisutne su u svim tumorskim stanicama, prisutne su pri dijagnozi i ostaju prisutne nakon što liječenje napreduje. Stoga, klonske mutacije imaju potencijal da se koriste kao terapijski ciljevi tumora. Subklonske mutacije prisutne su samo u podskupini stanica raka i mogu se otkriti na početku dijagnoze, ali nestaju s naknadnim recidivom ili se pojavljuju tek nakon liječenja. Heterogenost raka odnosi se na prisutnost više subklonskih mutacija u jednom raku. Važno je napomenuti da je velika većina klinički značajnih pokretačkih mutacija u svim uobičajenim vrstama raka klonske mutacije i ostaju stabilne tijekom progresije raka. Rezistencija, koja je često posredovana subklonovima, možda se ne otkriva u vrijeme dijagnoze, ali se pojavljuje kada se pojavi recidiv nakon liječenja.

Tradicionalna tehnika FISH ili stanični kariotip koristi se za otkrivanje promjena na kromosomskoj razini. FISH se može koristiti za otkrivanje genskih fuzija, delecija i amplifikacija te se smatra "zlatnim standardom" za otkrivanje takvih varijanti, s visokom točnošću i osjetljivošću, ali ograničenim protokom. Kod nekih hematoloških malignih bolesti, posebno akutne leukemije, kariotipizacija se još uvijek koristi za vođenje dijagnoze i prognoze, ali ovu tehniku ​​postupno zamjenjuju ciljani molekularni testovi poput FISH-a, WGS-a i NGS-a.
Promjene u pojedinačnim genima mogu se otkriti PCR-om, i PCR-om u stvarnom vremenu i digitalnim PCR-om s kapljicama. Ove tehnike imaju visoku osjetljivost, posebno su prikladne za otkrivanje i praćenje malih rezidualnih lezija i mogu dobiti rezultate u relativno kratkom vremenu. Nedostatak je što je raspon detekcije ograničen (obično se otkrivaju samo mutacije u jednom ili nekoliko gena), a mogućnost višestrukih testova je ograničena.
Imunohistokemija (IHC) je alat za praćenje temeljen na proteinima koji se obično koristi za otkrivanje ekspresije biomarkera poput ERBB2 (HER2) i estrogenih receptora. IHC se također može koristiti za otkrivanje specifičnih mutiranih proteina (kao što je BRAF V600E) i specifičnih genskih fuzija (kao što su ALK fuzije). Prednost IHC-a je što se može lako integrirati u rutinski proces analize tkiva, pa se može kombinirati s drugim testovima. Osim toga, IHC može pružiti informacije o subcelularnoj lokalizaciji proteina. Nedostaci su ograničena skalabilnost i visoki organizacijski zahtjevi.
Sekvenciranje druge generacije (NGS) NGS koristi tehnike paralelnog sekvenciranja visokog protoka za otkrivanje varijacija na razini DNA i/ili RNA. Ova se tehnika može koristiti za sekvenciranje i cijelog genoma (WGS) i genskih regija od interesa. WGS pruža najopsežnije informacije o genomskim mutacijama, ali postoje mnoge prepreke njegovoj kliničkoj primjeni, uključujući potrebu za svježim uzorcima tumorskog tkiva (WGS još nije prikladan za analizu uzoraka imobiliziranih formalinom) i visoku cijenu.
Ciljano NGS sekvenciranje uključuje sekvenciranje cijelog egzona i panel ciljnih gena. Ovi testovi obogaćuju područja interesa DNA sondama ili PCR amplifikacijom, čime se ograničava potrebna količina sekvenciranja (cijeli egzom čini 1 do 2 posto genoma, a čak i veliki paneli koji sadrže 500 gena čine samo 0,1 posto genoma). Iako sekvenciranje cijelog egzona dobro funkcionira u tkivima fiksiranim formalinom, njegov trošak ostaje visok. Kombinacije ciljnih gena relativno su ekonomične i omogućuju fleksibilnost u odabiru gena koji će se testirati. Osim toga, cirkulirajuća slobodna DNA (cfDNA) pojavljuje se kao nova opcija za genomsku analizu pacijenata oboljelih od raka, poznata kao tekuća biopsija. I stanice raka i normalne stanice mogu oslobađati DNA u krvotok, a DNA izbačena iz stanica raka naziva se cirkulirajuća tumorska DNA (ctDNA), koja se može analizirati kako bi se otkrile potencijalne mutacije u tumorskim stanicama.
Izbor testa ovisi o specifičnom kliničkom problemu koji treba riješiti. Većina biomarkera povezanih s odobrenim terapijama može se otkriti FISH, IHC i PCR tehnikama. Ove metode su razumne za otkrivanje malih količina biomarkera, ali ne poboljšavaju učinkovitost otkrivanja s povećanjem propusnosti, a ako se otkrije previše biomarkera, možda neće biti dovoljno tkiva za otkrivanje. Kod nekih specifičnih karcinoma, poput raka pluća, gdje je teško dobiti uzorke tkiva i postoji više biomarkera za testiranje, korištenje NGS-a je bolji izbor. Zaključno, izbor testa ovisi o broju biomarkera koji se testiraju za svakog pacijenta i broju pacijenata koji se testiraju na biomarker. U nekim slučajevima, korištenje IHC/FISH-a je dovoljno, posebno kada je cilj identificiran, kao što je otkrivanje estrogenskih receptora, progesteronskih receptora i ERBB2 kod pacijenata s rakom dojke. Ako je potrebno sveobuhvatnije istraživanje genomskih mutacija i potraga za potencijalnim terapijskim ciljevima, NGS je organiziraniji i isplativiji. Osim toga, NGS se može razmotriti u slučajevima kada su rezultati IHC/FISH dvosmisleni ili nejasni.

Različite smjernice daju smjernice o tome koji pacijenti trebaju biti podobni za genetsko testiranje. Godine 2020., ESMO-ova radna skupina za preciznu medicinu izdala je prve preporuke za NGS testiranje za pacijente s uznapredovalim rakom, preporučujući rutinsko NGS testiranje za uznapredovali neskvamozni nemikrocelularni karcinom pluća, rak prostate, kolorektalni karcinom, rak žučnih vodova i uzorke tumora raka jajnika, a 2024. godine ESMO je ažurirao smjernice na toj osnovi, preporučujući uključivanje raka dojke i rijetkih tumora. Kao što su gastrointestinalni stromalni tumori, sarkomi, rak štitnjače i rak nepoznatog podrijetla.
U 2022. godini, ASCO-ovo Kliničko mišljenje o testiranju somatskog genoma u bolesnika s metastatskim ili uznapredovalim rakom navodi da ako je terapija povezana s biomarkerom odobrena u bolesnika s metastatskim ili uznapredovalim solidnim tumorima, za te se pacijente preporučuje genetsko testiranje. Na primjer, genomsko testiranje treba provesti u bolesnika s metastatskim melanomom kako bi se otkrile mutacije BRAF V600E, budući da su inhibitori RAF i MEK odobreni za ovu indikaciju. Osim toga, genetsko testiranje treba provesti i ako postoji jasan marker rezistencije na lijek koji će se primijeniti pacijentu. Egfrmab je, na primjer, neučinkovit kod kolorektalnog karcinoma s mutacijom KRAS gena. Prilikom razmatranja prikladnosti pacijenta za sekvenciranje gena, treba integrirati fizičko stanje pacijenta, komorbiditete i stadij tumora, jer niz koraka potrebnih za sekvenciranje genoma, uključujući pristanak pacijenta, laboratorijsku obradu i analizu rezultata sekvenciranja, zahtijeva da pacijent ima odgovarajuću fizičku sposobnost i očekivano trajanje života.
Osim somatskih mutacija, neke vrste raka treba testirati i na gene zametne linije. Testiranje mutacija zametne linije može utjecati na odluke o liječenju raka poput mutacija BRCA1 i BRCA2 kod raka dojke, jajnika, prostate i gušterače. Mutacije zametne linije također mogu imati implikacije na buduće probire i prevenciju raka kod pacijenata. Pacijenti koji su potencijalno prikladni za testiranje na mutacije zametne linije moraju ispunjavati određene uvjete, koji uključuju čimbenike poput obiteljske anamneze raka, dobi pri dijagnozi i vrste raka. Međutim, mnogi pacijenti (do 50%) koji nose patogene mutacije u zametnoj liniji ne ispunjavaju tradicionalne kriterije za testiranje mutacija zametne linije na temelju obiteljske anamneze. Stoga, kako bi se maksimizirala identifikacija nositelja mutacija, Nacionalna sveobuhvatna mreža za rak (NCCN) preporučuje da se svi ili većina pacijenata s rakom dojke, jajnika, endometrija, gušterače, kolorektuma ili prostate testira na mutacije zametne linije.
Što se tiče vremena genetskog testiranja, budući da je velika većina klinički značajnih pokretačkih mutacija klonska i relativno stabilna tijekom progresije raka, razumno je provesti genetsko testiranje na pacijentima u vrijeme dijagnoze uznapredovalog raka. Za naknadno genetsko testiranje, posebno nakon molekularno ciljane terapije, testiranje ctDNA je povoljnije od DNA tumorskog tkiva, jer DNA krvi može sadržavati DNA iz svih tumorskih lezija, što je pogodnije za dobivanje informacija o heterogenosti tumora.
Analiza ctDNA nakon liječenja može predvidjeti odgovor tumora na liječenje i identificirati progresiju bolesti ranije nego standardne metode snimanja. Međutim, protokoli za korištenje ovih podataka za usmjeravanje odluka o liječenju nisu utvrđeni, a analiza ctDNA se ne preporučuje osim u kliničkim ispitivanjima. ctDNA se također može koristiti za procjenu malih rezidualnih lezija nakon radikalne operacije tumora. Testiranje ctDNA nakon operacije snažan je prediktor naknadne progresije bolesti i može pomoći u određivanju hoće li pacijent imati koristi od adjuvantne kemoterapije, ali se i dalje ne preporučuje korištenje ctDNA izvan kliničkih ispitivanja za usmjeravanje odluka o adjuvantnoj kemoterapiji.

Obrada podataka Prvi korak u sekvenciranju genoma je izdvajanje DNK iz uzoraka pacijenata, priprema biblioteka i generiranje sirovih podataka sekvenciranja. Sirovi podaci zahtijevaju daljnju obradu, uključujući filtriranje podataka niske kvalitete, usporedbu s referentnim genomom, identificiranje različitih vrsta mutacija putem različitih analitičkih algoritama, određivanje učinka tih mutacija na translaciju proteina i filtriranje mutacija zametne linije.
Anotacija gena vozača osmišljena je za razlikovanje mutacija vozača i putnika. Mutacije vozača dovode do gubitka ili pojačanja aktivnosti gena tumor supresora. Male varijante koje dovode do inaktivacije gena tumor supresora uključuju besmislene mutacije, mutacije pomicanja okvira čitanja i mutacije ključnih mjesta spajanja, kao i rjeđe delecije početnog kodona, delecije stop kodona i širok raspon mutacija umetanja/brisanja introna. Osim toga, missense mutacije i male mutacije umetanja/brisanja introna također mogu dovesti do gubitka aktivnosti gena tumor supresora kada utječu na važne funkcionalne domene. Strukturne varijante koje dovode do gubitka aktivnosti gena tumor supresora uključuju djelomičnu ili potpunu deleciju gena i druge genomske varijante koje dovode do uništenja okvira za čitanje gena. Male varijante koje dovode do pojačane funkcije onkogena uključuju missense mutacije i povremene insercije/brisanja introna koje ciljaju važne funkcionalne domene proteina. U rijetkim slučajevima, skraćivanje proteina ili mutacije mjesta spajanja mogu dovesti do aktivacije onkogena. Strukturne varijacije koje dovode do aktivacije onkogena uključuju fuziju gena, deleciju gena i duplikaciju gena.
Klinička interpretacija genomske varijacije procjenjuje klinički značaj identificiranih mutacija, tj. njihovu potencijalnu dijagnostičku, prognostičku ili terapijsku vrijednost. Postoji nekoliko sustava ocjenjivanja temeljenih na dokazima koji se mogu koristiti za vođenje kliničke interpretacije genomske varijacije.
Baza podataka precizne onkološke medicine (OncoKB) Centra za rak Memorial Sloan-Kettering klasificira genske varijante u četiri razine na temelju njihove prediktivne vrijednosti za uporabu lijekova: Razina 1/2, biomarkeri odobreni od strane FDA ili klinički standardni biomarkeri koji predviđaju odgovor određene indikacije na odobreni lijek; Razina 3, biomarkeri odobreni ili neodobreni od strane FDA koji predviđaju odgovor na nove ciljane lijekove koji su pokazali obećavajuće rezultate u kliničkim ispitivanjima, i Razina 4, biomarkeri koje nije odobrila FDA koji predviđaju odgovor na nove ciljane lijekove koji su pokazali uvjerljive biološke dokaze u kliničkim ispitivanjima. Dodana je peta podskupina povezana s otpornošću na liječenje.
Smjernice Američkog društva za molekularnu patologiju (AMP)/Američkog društva za kliničku onkologiju (ASCO)/Koledža američkih patologa (CAP) za tumačenje somatskih varijacija dijele somatske varijacije u četiri kategorije: Stupanj I, s jakim kliničkim značajem; Stupanj II, s potencijalnim kliničkim značajem; Stupanj III, klinički značaj nepoznat; Stupanj IV, za koji se ne zna da je klinički značajan. Samo varijante stupnja I i II vrijedne su za odluke o liječenju.
ESMO-ova ljestvica kliničke operabilnosti molekularnih ciljeva (ESCAT) klasificira genske varijante u šest razina: Razina I, ciljevi prikladni za rutinsku upotrebu; Faza II, cilj koji se još uvijek proučava, vjerojatno će se koristiti za probir populacije pacijenata koji bi mogli imati koristi od ciljnog lijeka, ali potrebni su dodatni podaci koji bi to podržali. Stupanj III, ciljane genske varijante koje su pokazale kliničku korist kod drugih vrsta raka; Stupanj IV, samo ciljane genske varijante podržane predkliničkim dokazima; U stupnju V, postoje dokazi koji podupiru klinički značaj ciljanja mutacije, ali terapija jednim lijekom protiv cilja ne produžuje preživljavanje ili se može usvojiti strategija kombiniranog liječenja; Stupanj X, nedostatak kliničke vrijednosti.